Producción de polihidroxialcanoatos (PHA) a escala piloto, una revisión

Se realizó una búsqueda bibliográfica en las bases de datos en línea Scopus y Web of Science, utilizando los términos expuestos en la Tabla 1 y los operadores booleanos AND, OR y NOT. Los filtros se ajustaron en cada base de datos para garantizar que la búsqueda se desarrollara dentro de los parámetros establecidos.

Con base en el número de artículos encontrados en cada plataforma y durante los meses de marzo y abril de 2022, se elaboró un diagrama PRISMA que integró los resultados obtenidos en ambas bases y para cada combinación de búsqueda utilizada, con el propósito de documentar de manera transparente y ordenada la información recopilada.

● Criterios de inclusión: idioma (español e inglés), acceso (libre), año de publicación (2012–2022, ambos incluidos), tipo de documento (artículo, revisión y capítulo de libro) y estado de publicación (final). ● Criterios de exclusión: literatura gris, documentos en idiomas distintos al español e inglés, tipo de documento (actas de conferencia, libros y encuestas breves) y estado de publicación (en revisión).

Tabla 2. Términos que integran los diferentes códigos de búsqueda

Parte de los códigos de búsqueda empleados fueron los siguientes: Scopus: ● TITLE-ABS-KEY ( polyhydroxyalkanoates AND pilot AND scale AND production ) AND ( LIMIT-TO ( OA , "all" ) ) AND ( LIMIT-TO ( PUBYEAR , 2022 – 2012 ) ) ● TITLE-ABS-KEY ( pha AND production ) AND ( LIMIT-TO ( PUBSTAGE , "final" ) ) AND ( LIMIT-TO ( OA , "all" ) ) AND ( LIMIT-TO ( DOCTYPE , "ar" ) OR LIMIT-TO ( DOCTYPE , "re" ) ) AND ( LIMIT-TO ( LANGUAGE , "English" ) OR LIMIT-TO ( LANGUAGE , "Spanish" ))

Web of Science: ● Polyhydroxyalkanoates (All Fields) AND pilot scale production (All Fields) AND 2009 OR 2008 (Exclude – Publication Years) ● Polyhydroxyalkanoates (All Fields) AND production conditions (All Fields) AND 2011 OR 2010 OR 2009 OR 2008 OR 2007 OR 2006 OR 2005 OR 2004 OR 2003 OR 2002 OR 2001 (Exclude – Publication Years) AND Articles OR Review Articles OR Proceedings Papers (Document Types) AND Review Articles (Document Types) AND Open Access AND Highly Cited Papers Una vez obtenidos los resultados en cada base de datos, se procedió a descargar las referencias en formato RIS y/o PubMed. Posteriormente, se importaron en la plataforma RefWorks y, mediante la herramienta “Encontrar duplicados”, se identificaron y eliminaron los documentos repetidos entre ambas bases.

Con el fin de establecer parámetros claros de evaluación para la información recopilada, se decidió considerar los criterios presentados en la Figura 3. Estos incluyen: el tipo de cultivo utilizado (puro o mixto); el tipo de sustrato empleado, definido también como la fuente de carbono, el rendimiento o cantidad total de producto reportado; y el procesamiento posterior (downstream) del bioproceso de producción, donde se incluyen los métodos específicos de extracción y purificación de los PHA. Figura 3. Criterios de comparación entre la información reportada La Figura 4 muestra la cantidad de información potencialmente útil identificada para la realización de este trabajo. Del total de documentos encontrados (N), sólo se seleccionaron 50 artículos. En términos generales, se observa una cantidad considerable de información proveniente de las dos bases de datos analizadas. En los recuadros laterales de la figura se presentan los criterios de inclusión y exclusión aplicados.

Figura 4. Diagrama Prisma de los resultados de búsqueda Tabla 3. Microorganismos, sustratos y resultados reportados en los artículos revisados

Tipo de cultivo y organismos En la Figura 5 se observa que, del total de artículos revisados, el 54.5 % empleó cultivos axénicos, mientras que el 45.5 % evaluó la producción de PHA mediante cultivos mixtos. Figura 5. Tipo de cultivo. A partir de la Figura 6, se aprecia que las bacterias constituyen el grupo de microorganismos más utilizado para la producción de PHA, seguidas por hongos y arqueas. Figura 6. Organismos usados para producción de PHA. El primer tipo de cultivo identificado es el cultivo puro o axénico. En este tipo de cultivo se utiliza únicamente una especie de microorganismo. Aunque estos procesos de fermentación producen elevados contenidos de PHA, el polímero resultante sigue siendo entre cuatro y nueve veces más costoso que los plásticos tradicionales (34). Para el año 2015, el precio promedio de los plásticos derivados del petróleo rondaba 1 USD/kg, mientras que el PHB se ubicaba alrededor de 5 USD/kg.

Una alternativa cada vez más atractiva frente a los cultivos puros es el uso de aguas residuales como sustrato, lo cual elimina la necesidad de condiciones de esterilidad, reduce costos y, de manera simultánea, contribuye a disminuir el impacto ambiental de estos residuos al reincorporarlos en la cadena productiva (34). Entre los microorganismos más utilizados en este tipo de procesos se destaca Cupriavidus necator (antes Ralstonia eutropha) (13,35), una bacteria oxidante de hidrógeno capaz de crecer en la interfaz de ambientes anaerobios y aerobios. Este microorganismo fue el primero empleado para la producción industrial de PHA en 1990, alcanzando una densidad celular superior a 200 g·L⁻¹ con más del 80 % de PHB en un fermentador de 1 m³ después de 60 horas de fermentación (36). Es además, el microorganismo más empleado debido a su capacidad de acumular hasta un 96 % del polímero en peso seco utilizando diversas fuentes de carbono, incluidos residuos agroindustriales y fuentes lignocelulósicas (37). No obstante, su producción comercial presenta como principal limitación el elevado costo asociado a la recuperación del PHA a partir del citoplasma bacteriano (38). Aunque C. necator es el organismo más citado, se ha reportado que el primer microorganismo descrito como productor de PHA fue Bacillus megaterium, cuyo sistema de PHA sintasa presenta características distintas a las de otros productores (8). Una propuesta innovadora para reducir costos consiste en el uso de cultivos microbianos mixtos (MMC), los cuales suelen operarse en tres etapas: (1) fermentación de la fuente de carbono para generar productos solubles precursores de PHA, (2) selección aeróbica de una comunidad microbiana enriquecida en bacterias acumuladoras de PHA y (3) producción del polímero bajo condiciones de limitación de crecimiento para maximizar la acumulación intracelular (4). Este enfoque, especialmente cuando utiliza residuos y subproductos industriales como sustratos, ha cobrado interés gracias a su potencial para reducir los costos de producción (16). Entre sus ventajas se destacan una menor exigencia en esterilización, reducción de costos del sustrato y la posibilidad de utilizar materias primas complejas (28). Las bacterias halófilas representan otro grupo de interés para la producción de PHA. Estas son capaces de crecer en concentraciones de NaCl entre 25 y 250 g·L⁻¹ y pueden metabolizar sustratos de bajo costo (8). Su tolerancia a altas concentraciones de sal, pH elevado y temperaturas superiores permite realizar procesos fermentativos en condiciones no estériles y continuas, reduciendo aún más los costos operacionales (39). También se han estudiado consorcios microbianos con alta capacidad de acumulación de PHA, como los dominados por Clostridium (29 %), Pseudomonas (8 %) y Rhodopseudomonas (5 %) en cultivos fotoheterótrofos obtenidos a partir de una columna de Winogradsky (7). Las diferencias entre sus rutas metabólicas pueden resultar en sinergias beneficiosas para la producción. El uso de bacterias fototróficas púrpuras ofrece otra alternativa. Estos organismos son altamente versátiles, con un metabolismo adaptable a diversos entornos, incluidos flujos complejos de residuos. Una parte clave de esta adaptabilidad radica en su capacidad de acumular PHA en condiciones de estrés (19). En cuanto a las cianobacterias fotoautotróficas, se ha documentado que diversas especies acumulan gránulos intracelulares de poli-β-hidroxibutirato como reserva energética y de carbono bajo condiciones adversas (40). Un ejemplo representativo es Synechocystis sp., una

cianobacteria unicelular de agua dulce capaz de crecer fototróficamente durante el día por fotosíntesis oxigénica y heterotróficamente durante la noche mediante glucólisis y fosforilación oxidativa (41). En el grupo de las arqueas destaca Haloferax mediterranei. Aunque menos estudiada que las bacterias (2,27), presenta ventajas importantes: su extrema resistencia a la contaminación gracias a la necesidad de altas concentraciones de sal (2–5 M NaCl), que inhiben el crecimiento de la mayoría de otros microorganismos, y la facilidad para recuperar el PHA mediante choque hipoosmótico tras reducir la salinidad del medio (27,42). El uso de organismos genéticamente modificados también ha adquirido relevancia. Por ejemplo, Yield10 Bioscience desarrolló en 2021 plantas de camelina capaces de acumular PHA en semillas, abriendo la posibilidad de producir bioplásticos a escala agrícola con costos similares a los aceites vegetales convencionales (43). De manera similar, el uso de sistemas recombinantes bacterianos ha permitido mejorar la acumulación del polímero. En 2015 se diseñó una cepa recombinante de E. coli con capacidad incrementada para producir PHB (44). Finalmente, a la hora de seleccionar el tipo de cultivo, es importante considerar que los cultivos puros presentan un riesgo elevado de contaminaciones bacterianas o fágicas. Además, los procedimientos de esterilización necesarios para prevenir estos eventos son costosos y complejos, lo que incrementa el costo final del biopolímero (36). Tipo de sustrato El tipo de sustrato o fuente de carbono es igual de importante que el tipo de cultivo y el microorganismo, ya que de este dependerá el rendimiento del proceso, la calidad del producto y el costo total de producción. Por esta última razón, diferentes residuos industriales han sido evaluados como sustratos para la producción de PHA, en lugar de emplear materias primas vírgenes (Figura 7). Figura 7. Tipos de sustratos para producción de PHA.

Los flujos de residuos de distintas industrias pueden utilizarse tanto como fuentes de carbono como de inóculo microbiano en los sistemas de producción de PHA. Entre estos residuos se encuentran las aguas residuales de plantas municipales o industriales (7), un enfoque especialmente atractivo para reincorporar un desecho a una nueva cadena de producción, minimizando así el impacto ambiental que generan en los ecosistemas o cuerpos de agua donde son vertidos. Entre los residuos probados como sustratos para la producción de PHA se encuentran los bioaceites, compuestos por alcoholes, furanos, derivados de benceno, aldehídos y azúcares (45). Estos se obtienen a partir de biomasa y se consideran combustibles de baja calidad que no pueden utilizarse en motores convencionales. Según un estudio realizado en 2014 (46), a partir de estos aceites se obtienen rendimientos de polímeros por sustrato similares o superiores a los conseguidos con acetato, aunque con un menor contenido de PHA. En un proceso de digestión anaerobia, el bioaceite fermentado podría emplearse directamente en la etapa de enriquecimiento de cultivos mixtos, aumentando la presión selectiva hacia microorganismos acumuladores de PHA (46). Otro tipo de residuo de interés es el suero de queso y el suero agotado de ricota, subproductos de la industria láctea. Solo el 50 % de su producción global se destina a la elaboración de productos alimenticios para humanos o animales. El excedente restante representa un problema ambiental debido a su elevada carga contaminante (47). Del proceso de recuperación de proteínas del suero se obtiene aproximadamente el 81 % de la lactosa originalmente presente en la leche, que ha demostrado ser una fuente de carbono adecuada para la producción de PHA mediante cultivos puros (16). Si se selecciona una MMC eficiente que acumule PHA y sea capaz de utilizar las proteínas como fuente de nutrientes, los costos operativos del proceso podrían reducirse considerablemente, ya que la suplementación externa de nutrientes se eliminaría o disminuiría. El suero agotado de ricota fue empleado como sustrato en un estudio con Pseudomonas putida SS9 (19), dada su elevada concentración de nutrientes fermentables como lactosa, lípidos, proteínas solubles, ácido cítrico y vitaminas del grupo B. Estas características lo convierten en un sustrato confiable para la producción económica de PHA a gran escala (17). En 2022 se desarrolló un estudio cuyo objetivo fue producir PHB utilizando papel de oficina como sustrato mediante Cupriavidus necator, empleando un enfoque de sacarificación y fermentación simultánea por lotes y alimentación por pulsos. Este tipo de operación ha sido repetido con otros sustratos como se evidencia en la Tabla 4, donde se observa que el valor de productividad más alto reportado corresponde a Cupriavidus necator utilizando salvado de trigo como sustrato.

Tabla 4. Peso seco de las células (CDW) y rendimiento de PHB de C. necator y Burkholderia sp. utilizando varias biomasas lignocelulósicas (LCB) a través del modo SHF y SSF. Tomada de: (12) Otro desecho clave es la mezcla de vinazas y melazas, o las melazas por separado, subproductos derivados de la caña de azúcar obtenidos durante los procesos de fermentación y destilación de materias primas. Las vinazas, en particular, constituyen el principal residuo orgánico generado en la producción de alcohol. La industria del bioetanol a base de caña de azúcar produce entre 10 y 15 litros de vinaza por cada litro de etanol (20), y su liberación a los cuerpos naturales de agua o al suelo puede ocasionar contaminación debido a su elevado contenido orgánico, mineral y de elementos esenciales para las plantas, además de su carácter altamente corrosivo por su pH ácido. En un estudio se evaluó la producción de PHA por Bacillus subtilis y Escherichia coli, aislados de muestras de suelo contaminado, utilizando melaza de caña como sustrato (10,48). Por último, se encuentra el glicerol crudo (GC), un subproducto de la producción de biodiésel. Este es un sustrato orgánico rico en carbono con gran potencial como materia prima para la producción de PHA. Considerando su aplicación a gran escala, se ha estimado que una planta de biodiésel con una capacidad de 38 millones de litros (10 millones de galones) por año podría producir, mediante el uso de consorcios mixtos, hasta 19 toneladas métricas de PHB anuales (21). El tipo de sustrato se presenta como uno de los parámetros de mayor relevancia, dado que tiene una relación directa con la producción de PHA. El uso de fuentes de carbono puras puede aumentar considerablemente los costos; por ello, un enfoque atractivo consiste en emplear residuos orgánicos y aguas residuales derivados de la actividad antropogénica. Esto no solo significa una reducción importante en los costos de producción, sino que además contribuye al manejo adecuado de residuos, una de las problemáticas ambientales más urgentes a nivel global (47,48). En este sentido, se han utilizado diversos residuos como sustratos: papel de oficina triturado (12), hidrolizado de madera procedente de una biorrefinería forestal (15), melaza de caña (10), mezclas de vinazas y melazas (20), y residuos de frutas fermentadas (4). Es importante tener en cuenta que, según el tipo de sustrato, puede presentarse carencia de ciertos nutrientes esenciales para el microorganismo, mientras que otros pueden encontrarse en exceso. Esto obliga a considerar la suplementación nutricional adecuada para optimizar el proceso.

Entendiendo el rendimiento como la cantidad de producto obtenido bajo condiciones reales por unidad de tiempo, dentro de los resultados analizados destacan estudios como el realizado con A. hydrophila, empleada para la producción a gran escala de PHBHHx en un fermentador de 20.000 L. En dicho estudio, la cepa alcanzó en 46 horas una concentración celular final de 50 g L⁻¹, un peso seco de PHBHHx de 25 g L⁻¹ y un contenido de PHA equivalente al 50 %. Si bien estos valores son representativos, siguen siendo inferiores a los obtenidos con R. eutropha, considerada una de las especies más eficientes en la producción de PHA. Por su parte, consorcios microbianos integrados por Clostridium, Pseudomonas y Rhodopseudomonas presentan una capacidad máxima de almacenamiento de PHA del 44 % respecto al peso celular seco, lo que equivale aproximadamente a 320 mg de PHA por cada 800 mg de biomasa por litro (7). Dentro de los valores reportados, los datos más bajos de producción corresponden a Rhodobacter sphaeroides RV alimentada con fermentado de aceite de palma, con rendimientos cercanos a 1 g L⁻¹ d⁻¹. En contraste, uno de los valores más altos se registró en Bacillus subtilis, alimentada con melaza de caña, alcanzando un máximo de 18.9 g L⁻¹ (10). Le sigue Escherichia coli, también cultivada con melaza de caña, con un rendimiento máximo de 9.62 g L⁻¹ (10). Procesamiento posterior (Downstream) En cuanto a las estrategias empleadas para la recuperación del polímero, el método más utilizado continúa siendo el uso de disolventes orgánicos, como cloroformo y etanol. Este enfoque es ampliamente adoptado debido a su alta eficiencia de extracción. Le sigue, con un 42 %, la digestión, la cual puede llevarse a cabo mediante procedimientos enzimáticos o químicos, dependiendo del microorganismo y del tipo de matriz celular. Finalmente, se emplea el método de flotación, un proceso de separación sólido–líquido o líquido–líquido basado en la diferencia de densidades. Este método es aplicable cuando las partículas a separar presentan una densidad menor que la del líquido en el cual se encuentran suspendidas. Según el tipo de microorganismo empleado, se determina la técnica de lisis y el método de filtración–purificación para la obtención de PHA, siendo este uno de los procesos más demandantes del bioproceso completo. Se sabe, además, que el procesamiento posterior contribuye al costo total de producción debido a la alta acumulación intracelular de PHA y al rendimiento relativamente bajo del producto recuperado. Por lo tanto, es necesario investigar distintas estrategias de extracción y purificación que permitan que el proceso sea económicamente viable y ambientalmente sostenible (14). Se han explorado múltiples alternativas de recuperación con el fin de encontrar métodos más económicos para aislar y purificar el PHA. Tras la fermentación, las células bacterianas que contienen el polímero se separan del medio mediante centrifugación. Posteriormente, la extracción y purificación pueden realizarse por diversas rutas. La mayoría de los métodos existentes emplean disolventes orgánicos como acetona o cloroformo; sin embargo, un

inconveniente importante de la extracción directa con disolventes es que la alta viscosidad de la solución de PHA dificulta la eliminación completa de la biomasa residual. Como alternativa, se han adoptado métodos sencillos y eficaces como la lisis química mediante hipoclorito de sodio. Este procedimiento fue utilizado con éxito en Pseudomonas putida utilizando suero de leche como sustrato, obteniéndose resultados favorables (17). Otro enfoque emergente corresponde a los métodos de purificación biológica, utilizados para eliminar impurezas como CO₂ y H₂S. Estos métodos están recibiendo mayor atención debido a normativas ambientales cada vez más estrictas, que exigen procesos más limpios y seguros (22). Debe considerarse que tanto los cultivos puros como los recombinantes requieren condiciones estrictamente estériles y fuentes de carbono específicas, seguidas de etapas de recuperación y purificación altamente controladas. Esto se traduce en costos de producción que pueden ser entre cuatro y nueve veces superiores a los de los plásticos convencionales (49). Propuestas emergentes para la optimización de la producción de PHA A partir de la literatura analizada, se identifican dos líneas principales de investigación orientadas a mejorar la eficiencia y la viabilidad económica del proceso de producción de PHA. La primera contempla el uso de Bacillus subtilis en sistemas de cultivo por lotes alimentados, empleando aguas residuales como sustrato primario. Este enfoque se sustenta en el rendimiento reportado para B. subtilis (10) y en la elevada carga orgánica de las aguas residuales, las cuales representan una fuente accesible y de bajo costo. Para garantizar la disponibilidad de carbono, diversos autores sugieren el uso de glucosa suplementaria como medida preventiva ante posibles deficiencias. La segunda línea corresponde a estrategias basadas en cultivos mixtos, mediante la conformación de consorcios microbianos integrados por especies con altas tasas de acumulación de PHA, como Azotobacter vinelandii, Cupriavidus necator y Pseudomonas oleovorans. La combinación de microorganismos con fisiologías complementarias podría favorecer la estabilidad metabólica del sistema y mejorar la eficiencia global del proceso. En los estudios revisados, este tipo de consorcios ha mostrado un mejor desempeño cuando se emplean aguas residuales suplementadas con NaCl al 1% (p/v). Asimismo, se destaca que A. vinelandii presenta un perfil nutricional distinto al de las otras especies, lo cual podría reducir la competencia intra-consorcio. La literatura también enfatiza la influencia determinante de variables operacionales como el pH, la velocidad de agitación, el tipo de soporte, el diseño del biorreactor y las condiciones de oxigenación. La evaluación sistemática de estos factores se ha visto facilitada por herramientas estadísticas como los diseños de Plackett–Burman, ampliamente utilizados en la optimización de procesos biotecnológicos. Aunque el tipo de biorreactor no fue discutido en profundidad en los estudios considerados, sí se reconoce su impacto directo en los costos de producción. En particular, se ha señalado que la fermentación en estado sólido puede reducir los costos de fabricación debido a la menor necesidad de etapas complejas de recuperación (downstream) y a su capacidad para trabajar con concentraciones más elevadas de sustrato. Esta modalidad también permite reducir el

volumen de los reactores y aprovechar la ventilación natural a través de los espacios interpartículas (8). Finalmente, numerosos autores coinciden en la necesidad de incrementar los esfuerzos orientados a mejorar tanto la eficiencia del proceso como su viabilidad económica, con el fin de ampliar la producción y las aplicaciones industriales de los PHA (50). En este contexto, las herramientas de ingeniería genética emergen como una alternativa prometedora, ya que permiten modificar o diseñar genes en bacterias, hongos y microalgas para incrementar su capacidad natural de acumulación de PHA, tomando como referencia los microorganismos con mejores rendimientos.

La revisión realizada evidencia un volumen considerable de estudios orientados a identificar las condiciones que optimizan la producción de polihidroxialcanoatos (PHA), así como sus posibles rutas de valorización. Los resultados reportados confirman el creciente interés industrial por estos biopolímeros, cuya aplicación se ha extendido a sectores como la industria farmacéutica (suplementos), biomédica (dispositivos sanitarios y reparación de tejidos) y alimentaria (empaques), entre otros. En relación con los insumos y configuraciones de cultivo, se observa que los sustratos puros continúan siendo los más utilizados (30%), seguidos por las aguas residuales (25%). Asimismo, los cultivos axénicos representan la mayoría de los casos analizados (54,5%), lo cual se atribuye a sus elevados porcentajes de acumulación de PHA. Entre los microorganismos empleados, las bacterias destacan ampliamente (65%), reflejando su robustez metabólica, facilidad de manipulación y disponibilidad de información genética. A partir del análisis comparativo de los estudios, se identifican dos estrategias con potencial para el mejoramiento de la producción de PHA. La primera consiste en el uso de Bacillus subtilis bajo un esquema de lotes alimentados, empleando aguas residuales como fuente de carbono y suplementándolas con glucosa para asegurar la disponibilidad del sustrato. La segunda estrategia contempla el establecimiento de un cultivo mixto integrado por Azotobacter vinelandii, Cupriavidus necator y Pseudomonas oleovorans, utilizando efluente industrial textil enriquecido con hidrolizado de madera. Ambas alternativas buscan equilibrar la eficiencia del proceso con la reducción de costos mediante el aprovechamiento de corrientes residuales y el uso de microorganismos con elevada capacidad de acumulación de PHA.

Esta revisión de literatura fue presentada como trabajo de grado para optar por el título de microbiología industrial. No se recibió financiamiento por la escritura de este artículo de revisión. Conflicto de interés La autora declara que no existen conflictos de interés.